活細胞熒光示蹤探針FDA[熒光素二乙酸鹽]

FDA（熒光素二乙酸酯）是一種非熒光疏水性熒光素衍生物，可以通過(guò)細胞膜（包括哺乳動(dòng)物和細菌細胞），因此細胞內酯酶水解產(chǎn)生高熒光產(chǎn)物熒光素的二乙酸酯基團。熒光素分子在具有完整膜的細胞中積累，作為細胞活力的標記。不具有完整細胞膜或活性代謝的細胞可能不會(huì )積聚熒光產(chǎn)物，因此不會(huì )表現出綠色熒光。FDA可以與PI染色組合使用，因為非活細胞攝取PI并將死細胞染成紅色，而活細胞不吸收PI并且應該僅染色綠色。與單色分析相比，非活細胞和活細胞的這種雙色分離可以提供更準確的細胞活力定量。

 操作步驟 1.準備2-10 mM DMSO儲備溶液 將4.2mg溶于1ml DMSO中以制備10mM儲備溶液（1mg / ml相當于~2.4mM） 注意：應立即使用原液; 應將任何剩余的溶液等分并在<-20℃冷凍。 避免反復凍融循環(huán)，避免光照。 

               2.準備染料工作溶液 在使用之前，通過(guò)用Hanks和20mM Hepes緩沖液（HHBS）或您選擇的緩沖液（pH7）稀釋步驟1中的DMSO儲備溶液，準備1至20μM染料工作溶液。通過(guò)渦旋混合均勻。   

               3.用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞：

              3.1用測試化合物細胞培養一段所需的時(shí)間。

              3.2離心細胞，每管2-10×105個(gè)細胞。 

              3.3在500μL染料工作溶液中重懸細胞（來(lái)自步驟2）。 

              3.4在室溫或37°C下用染料溶液孵育細胞15至30分鐘，避光。 

              3.5從細胞中取出染料工作溶液，用HHBS或您選擇的緩沖液清洗細胞。 將細胞重懸于500μL預熱的HHBS或培養基中，得到每管2-10×105個(gè)細胞。

              3.6用流式細胞儀（FL1通道）或熒光顯微鏡觀(guān)察Ex / Em = 490 / 520nm處的熒光變化。 注意：對于細菌細胞染色：當通過(guò)測試細菌過(guò)夜生長(cháng)預處理的營(yíng)養肉湯中1：800稀釋儲備溶液時(shí)，染色是最有效的，但也可以使用新鮮營(yíng)養肉湯或PBS。 

                  細菌懸浮液應用PBS 稀釋至每毫升105-107個(gè)生物。 可以通過(guò)將1ml溶液施加到.45μm過(guò)濾器（25mm）并真空過(guò)濾除去溶液，然后加入1ml染料溶液并在室溫下孵育5-10分鐘來(lái)染色細菌。