Annexin V, TRITC標記

膜聯(lián)蛋白V是研究細胞凋亡的有價(jià)值的工具。它用作檢測在細胞表面表達磷脂酰絲氨酸的細胞的探針，這是細胞凋亡以及其他形式的細胞死亡中發(fā)現的特征。有多種參數可用于監測細胞活力。Annexin V-dye共軛物被廣泛用于通過(guò)測量磷脂酰絲氨酸（PS）的轉運來(lái)監測細胞凋亡。在細胞凋亡中，PS轉移到質(zhì)膜的外部小葉。磷脂酰絲氨酸在細胞表面的出現是細胞凋亡初始/中間階段的普遍指標，可以在觀(guān)察形態(tài)變化之前進(jìn)行檢測。這種熒光TRITC-Annexin V偶聯(lián)物廣泛用于通過(guò)流式細胞儀或熒光顯微鏡監測細胞凋亡。對于基于膜聯(lián)蛋白V的細胞凋亡檢測的微孔板檢測，我們建議您使用Cell Meter?試劑盒。

操作步驟

1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細胞：

1.1     制備膜聯(lián)蛋白V綴合測定緩沖液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl ₂，pH 7.4。

1.2     用測試化合物處理細胞一段所需的時(shí)間（用星形孢菌素處理的Jurkat細胞4-6小時(shí)）以誘導細胞凋亡。

1.3     離心細胞，得到1-5×10 ⁵個(gè)細胞/管。

1.4     將細胞重懸于200μLAnnexin V結合測定緩沖液中（來(lái)自步驟1.1）。

1.5     在細胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結合物。

可選：在細胞內加入死細胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細胞。

1.6     余ncubate在室溫下進(jìn)行30至60分鐘，避光。

1.7     在用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，加入300μLAnnexin V結合測定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）以增加體積（參見(jiàn)下面的步驟1.8）。

1.8     使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監測熒光強度（參見(jiàn)下面的步驟2或3）。

2.使用流式細胞儀分析：

通過(guò)使用具有適當過(guò)濾器的流式細胞儀來(lái)量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意：粘附細胞上的膜聯(lián)蛋白V 結合流式細胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測，因為在細胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。

3.使用熒光顯微鏡分析：

3.1     移液器從步驟1.6，將細胞懸浮液沖洗1-2次用甲nnexin V-結合測定緩沖液（來(lái)自步驟1.1） ，然后與A重懸細胞 nnexin V-結合測定緩沖液（來(lái)自步驟1.1） 。將細胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意：對于粘附細胞，建議直接在蓋玻片上生長(cháng)細胞。與膜聯(lián)蛋白V綴合物（步驟1.6）孵育后，用Nnexin V結合測定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）沖洗1-2次，并將A nnexin V結合測定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）加回到蓋玻片中。在玻璃載玻片上翻轉蓋玻片并觀(guān)察細胞。在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀(guān)察。

3.2     在熒光顯微鏡下用適當的濾光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細胞。